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Cromatografía de columna

Cromatografía de columna


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Allí cromatografia (del griego χρῶμα, transcrito en khrôma, “color”), es una técnica para separar los componentes de una mezcla homogénea basada en la distribución de sus componentes entre dos fases, una estacionaria y otra que se mueve en una dirección definida. Encromatografía de columnala dirección va de arriba a abajo y está dictada por un tubo de vidrio (la columna).

Allí cromatografía de columna es una técnica cromatográfica particular que se basa en la propiedad que tienen algunas sustancias, una vez disueltas en soluciones adecuadas, de interactuar con una matriz sólida adecuadamente preparada. ¡Intentaré explicar mejor lo que significa lo que acabo de escribir!

Cromatografía en columna: que es

No es más que un método de separación cromatográfica que se realiza en una columna de vidrio. Esta técnica aprovecha la diferencia de carga, tamaño, afinidad de enlace u otras propiedades del componente a aislar para crear bandas con diferentes características.

En las fotos de esta página, te mostramos las secuencias delcromatografía de columnay en particular la extracción del eluido, que es la sustancia "parcialmente purificada" que sale del pico terminal de la columna de vidrio.

Allícromatografía de columnaes muy útil para la purificación de proteínas y para la separación de un gran número de sustancias a examinar individualmente. A veces, sustancias aisladas concromatografía de columna pierden las propiedades que tenían dentro de la mezcla. Todo depende de la técnica decromatografía de columnay de la sustancia que desea depurar.

Cromatografía en columna: cómo funciona

Un tubo de vidrio se llena con un material sólido poroso, definido como "fase estacionaria". La fase estacionaria tiene propiedades químicas adecuadas elegidas en base a la sustancia a purificar / separar de la mezcla. A continuación, la columna se llena con una solución tampón, también adecuadamente formulada. La solución tampón se llama "fase móvilY contiene la mezcla que desea separar.

La mezcla a separar se disuelve enfase móvil. Luego viene la fase móvilen capasen la cima delcolumnay filtrado a través de lafase estacionaria(la matriz sólida). De esta manera, la solución se difunde a lo largo delcolumnay forma una banda continua a lo largo de toda la fase estacionaria. Las sustancias que eluyen (salen) de la columna tienen propiedades específicas basadas en el orden de evitación.

Para entenderlo mejor, tomemos el ejemplo de la purificación de proteínas, incluso si la fase móvil puede estar representada por cualquier mezcla. Haremos que las proteínas individuales eluyan del columna más o menos rápidamente según sus propiedades.

Según el tipo de fase estacionaria, disponemos de diferentes técnicas decromatografía de columna, Cuales:

  • Cromatografía de intercambio de iones
  • Cromatografía de exclusión molecular
  • Cromatografía de afinidad

También existe una técnica más cara que utiliza alta presión, a saber, lacromatografía líquida de alta presióno HPLC.

Cromatografía de intercambio de iones

En cromatografía de intercambio de ionesla matriz sólida (fase estacionaria) es rica en cargas positivas o negativas. No hace falta decir que elcromatografía de intercambio de ionesaprovecha las diferencias en el tipo e intensidad decarga eléctrica netaa un cierto pH.

En este caso, elfase estacionariaes un polímero sintético (resina) que contiene grupos cargados negativamente (de ahí que hablamos deintercambiadores de cationes) o grupos cargados positivamente (hablamos descabers de aniones).

Volviendo al ejemplo de la purificación de proteínas, la diferencia de carga está ligada a la presencia de aminoácidos con determinados grupos funcionales. La afinidad de cada proteína por los grupos cargados decolumnadepende del pH que a su vez afecta el estado de ionización de los grupos funcionales de los aminoácidos constituyentes.

Encromatografía de columnala solución que se prepara para la fase móvil es fundamental. En nuestro ejemplo con proteínas, la concentración de sal y el pH pueden crear un gradiente que puede favorecer la extrusión de ciertas proteínas.

Cromatografía iónica: intercambio catiónico

En el caso de cromatografía iónicacon la matriz de intercambio catiónico, la matriz sólida tiene grupos cargados negativamente, por lo que las proteínas con carga neta positiva serán las últimas en fluir de la columna. Los primeros compuestos que salieron delcolumnaserán los que tengan una fuerte carga neta negativa (por repulsión de la matriz), entonces saldrán sustancias con carga parcial negativa. Las sustancias a eluir se moverán a través delcolumnacon una tasa que depende de su cargo neto en la solución utilizada.

Cromatografía de exclusión molecular

En este caso, la mezcla (fase móvil) se agrega en unacolumnaque contiene unpolímerocon enlaces cruzados y moléculas deaislarestarán separados por tamaño. Instintivamente uno piensa que las moléculas más pequeñas saldrán primero de la columna, pero en realidad es exactamente lo contrario.

Las moléculas más grandes se verán obligadas a viajar por el camino más corto hasta el final de la columna. Por difusión, las moléculas más pequeñas podrán penetrar libremente en los poros de la matriz sólida y tardarán más en eluir. El primer eluido recogido será el que contenga las moléculas más grandes.

Cromatografía en columna de afinidad

Un ligando está presente en la fase estacionaria. A medida que la solución a separar pasa a través de la columna, las moléculas que tienen afinidad por ese ligando formarán un enlace específico. Las sustancias de interés se mantendrán en la primera o última fracciones recolectadas según el tipo de ligando utilizado.

Cromatografía líquida de alta presión

Las técnicas decromatografía de columnarecién descrito puede tener una resolución discreta de las bandas. ¿La razón? Cada sustancia tiende a difundirse después de cierto tiempo.

Al usar bombas de alta presión, la velocidad aumenta y el tiempo que tardan las moléculas en recorrer la columna disminuye. En este contexto, se requieren matrices cromatográficas capaces de soportar fuertes presiones.

Al reducir el tiempo de tránsito a través de la columna, elcromatografía líquida de alta presión(HPLC) limita la extensión de las bandas y mejora en gran medida la resolución del eluido recogido.


Video: Cromatografia en columna de sustancias coloreadas (Junio 2022).